齧齒類（lèi）實驗動物是使用最多的實驗動物，其微生物質量控製一直是（shì）實驗動物（wù）設（shè）施管（guǎn）理（lǐ）者的工作重點。每個（gè）設施都有自己的動物（wù）健康監測方案，其中（zhōng）哨兵鼠（Soiled Bedding Sentinels, SBS）長期以來應用最為廣泛。但由於哨兵鼠方案本身存在的一些（xiē）缺點，常常無法及時（shí）有效地監測微生物汙染的發（fā）生，且需要額外使用動物，並不符合3R原則（詳見本號前期文章：哨兵（bīng）鼠設置，你想知道的（de）都在）。

近（jìn）幾年，國際上（shàng）有越來越多的設施將環境樣本PCR檢測（Environmental Health Monitoring, EHM）作為哨兵鼠方案（àn）的補充或替代方案，以（yǐ）便更及時靈敏地監測動（dòng）物（條件）致病微（wēi）生物感（gǎn）染（rǎn）和攜（xié）帶狀況。我國也有少數設施采取這（zhè）種監測方案。該方案不僅提高了檢測的敏感性，還減（jiǎn）少了動物使用數量，同時在哨（shào）兵鼠設置和飼養上的時間和金錢成（chéng）本也得（dé）到了（le）節省（shěng）。隨著（zhe）該方法的不斷優化和普及，哨兵鼠（shǔ）方案在（zài）歐美多（duō）國有逐漸被取（qǔ）代的趨勢。本文就簡要（yào）介紹一下EHM方案。

1、EHM方案的采樣方式

EHM方案最（zuì）早采用（yòng）無菌（jun1）拭子擦拭附著（zhe）在出風口的粉塵（Exhaust Air Dust，EAD），或用特定大小的紗布或濾紙固定在（zài）出風口初效（xiào）過（guò）濾器上收（shōu）集粉塵。後來泰尼百斯、Allentown等籠（lóng）具公司（sī）設計了專門的采樣口/卡（kǎ）槽並配套使用（yòng）采樣卡，使得樣本采集更（gèng）加簡便，並標準化。這兩種方法都需要廢氣（qì）排（pái）出時不能在籠盒水（shuǐ）平進行空氣過（guò）濾。目前（qián）在美國、加拿大等國家這兩種方法都是被普（pǔ）遍使用的采樣（yàng）方式。

近幾年，將植絨（róng）拭子、濾紙等介質（zhì）放入髒墊料盒中代替哨兵（bīng）鼠，通過充分接觸可能存在的病原微生物進行采樣的方法也被逐步采（cǎi）用。該方（fāng）法不僅適用於所（suǒ）有設計形式（shì）的籠具，同時還可有效避免由於籠架清洗不（bú）充分所殘留的核酸引起（qǐ）的假陽性結果。

不論是使用哪種采樣方（fāng）式，獲取的樣本都是用PCR方法檢測目標病原體核酸，而由於PCR方法的高敏感性，因此足以（yǐ）檢測（cè）到樣本中的微量核酸。

Jensen, JAALAS, 2013

Miller, JAALAS, 2016

Mahabir, Lab Anim., 2018

Pettan-Brewer，JAALAS, 2020

Varela，JAALAS, 2022

2、檢測結果（guǒ）的準確性

在（zài）綜合分（fèn）析了已公開發表的33篇文獻後發現，髒墊料（liào）哨兵鼠方案對各種病原體的（de）總檢出率約76%，而EHM的檢出率約96%。（詳見表1）

目（mù）前小鼠肝炎病毒、小鼠細小病毒、仙台病毒、嗜肺巴（bā）斯德杆菌、螺（luó）杆菌、鞭毛蟲、蟯蟲及蟎蟲等多種病原體都已證（zhèng）實可在EAD樣本中準確檢出。特別（bié）是其中有些病原體在髒墊料哨兵鼠方案會漏檢，但（dàn）卻可以成功通過EHM檢測到，例如仙台病毒、嗜肺巴斯德杆菌、螺杆菌、鼠阿米巴、蟯蟲等。但是也有一些病原（yuán）體（tǐ），尚未證實可以檢出，或不同研（yán）究顯示其檢測效果尚有爭議，例（lì）如輪狀（zhuàng）病（bìng）毒（dú）、鏈球菌等。

表1：不同病原體在髒墊料（liào）哨兵（bīng）鼠和環境樣本中的檢出情況

*：檢（jiǎn）出某病原體的文章數量（liàng）/評估某病原體的（de）文章數量

3、歐美實驗動物設施EHM使用情況

一項覆蓋（gài）美國、加拿大、歐洲、英國等多個國家和地區的111個動物設施（shī）的調查報告顯示，在大小鼠的月（yuè）度和（hé）季度常規健康監測中，有11%的設施單獨使用EHM，41%的設（shè）施單獨使（shǐ）用髒墊料哨兵鼠，46%的設施使用多種（zhǒng）方案組合（hé），此外有2%的設施不（bú）進行常規健康監測。

對（duì）於檢疫期齧齒類動物，由於有更高的時效性要求，有更多人會選擇（zé）EHM方案，在被調查的111個設施中，63%的機構（gòu）單獨使用EHM，15%的設施單獨使用髒墊料哨兵鼠方案，14%的設施（shī）使用多種方法組合，還有8%的設施不（bú）檢測檢疫期動物。

由以（yǐ）上數據可以看（kàn）出，目前在檢疫檢測中，由於EHM可以更快反（fǎn）饋（kuì）結果，因而使用更廣泛，但在常規健康監測中用EHM將髒墊料哨兵鼠完全替代的還是少數。但業內人（rén）士普遍相信（xìn），隨著越來越多的數據支（zhī）持、廣（guǎng）泛的（de）宣傳和專業指導（dǎo），使用EHM方案的設施數量會越來越多。

4、實施EHM監測前應該評估的內容

籠架和籠盒構造（zào）可能是在實施EHM方案前最需要考慮（lǜ）的因素。如何采樣、采樣位置選擇將直接影響監測效果，因此建議對（duì）於不同類型、不同廠家的籠具都應該充分驗證采（cǎi）樣時間、方式和位置後再正式使用。

如果設施中曾經發（fā）生過某種微生物汙染，或所使用的墊飼料中（zhōng）殘留某（mǒu）種微生（shēng）物的核酸（suān），那籠（lóng）架出風口粉塵樣本中就很可能存在其核酸片段，這就會（huì）造（zào）成假陽性結果。例如（rú），某設施在做驗證時發現在用出風口粉（fěn）塵樣本檢（jiǎn）測時可以檢測到大量綠膿杆菌核酸，但最終證實動物並沒有感染，環境中也沒有活菌，而是所使（shǐ）用的飼料中存在綠膿杆菌核酸，這種混淆會耗費大量精力和成本。

對於多數設施來說，使用哨兵鼠方案則可以通過購買商業化（huà）試劑進行自檢，但如（rú）果（guǒ）使用EHM方（fāng）案，則需要進行PCR自檢，那很可能（néng）由於方法驗證不（bú）充分、實驗室條（tiáo）件不適宜（yí）、氣溶膠汙染等多種因素造成實驗結果的不可靠。如果將EHM樣本送檢專業（yè）第三方檢測機構，檢測成本則要明顯高於哨兵鼠檢測。盡管在哨兵鼠購買、飼養、樣（yàng）本采集等方麵需要（yào）消耗更多資（zī）金和勞（láo）動力成本，甚至經過折算這部分（fèn）成本是高於支出的檢測費的，但相較於檢測費，這些成（chéng）本更為“隱形”。

由於（yú）標（biāo）準更新的（de）周期（qī）漫長，目前國標GB/T 14926中檢測病原微生物的主要方法是血清學方（fāng）法、培養法和鏡檢法，而極少提及分子（zǐ）生物（wù）學方（fāng）法，這（zhè）也使得不同實驗室間方法不統一，使得其推廣（guǎng）應用及不同機構（gòu）間互認的阻（zǔ）礙增加。

展望

總而言之，目前在美國、加拿大、歐洲等國家和地區，EHM的驗證和應用越來越廣泛，已經有少數設施完（wán）全取消了髒墊料哨兵鼠的使用，每年（nián）可減少數（shù）萬隻（zhī）哨兵動物的使用。我國開展驗證和應用EHM方案的機構數量還十分稀少，但是（shì）也逐漸有越來越多的設施管理者開始關注並嚐試。所以短期內髒（zāng）墊（diàn）料哨兵鼠還是會被廣泛應用，但是（shì）隨著管理人員對結果時效性、敏感性的要求的提高和方法的充分驗證，EHM一定會（huì）被更多使用，並逐步替代哨兵鼠方案。

參考文（wén）獻：

1. Luchins KR, Gates KV, Winn CB, Manuel CA, Pettan-Brewer C, Foley PL, Peterson NC, Garner JP, Hanson W, LaFollette MR. A Cross-sectional Survey on Rodent Environmental Health Monitoring Practices: Benchmarking, Associations, and Barriers. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2023 Jan 1;62(1):64-73. doi: 10.30802/AALAS-JAALAS-22-000086. PMID: 36755202; PMCID: PMC9936849.

2. https://na3rc.sharepoint.com

3. Winn CB, Rogers RN, Keenan RA, Gerwin PM, Matthews KA, Ramirez JA, Bennett TE, Perkins CL, Henderson KS. Using Filter Media and Soiled Bedding in Disposable Individually Ventilated Cages as a Refinement to Specific Pathogen-free Mouse Health Monitoring Programs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2022 Jul 1;61(4):361-369. doi: 10.30802/AALAS-JAALAS-22-000013. Epub 2022 Jun 24. PMID: 35750479; PMCID: PMC9674011.

4. Mailhiot D, Ostdiek AM, Luchins KR, Bowers CJ, Theriault BR, Langan GP. Comparing Mouse Health Monitoring Between Soiled-bedding Sentinel and Exhaust Air Dust Surveillance Programs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2020 Jan 1;59(1):58-66. doi: 10.30802/AALAS-JAALAS-19-000061. Epub 2019 Dec 20. PMID: 31862019; PMCID: PMC6978580.

5. de Bruin WC, van de Ven EM, Hooijmans CR. Efficacy of Soiled Bedding Transfer for Transmission of Mouse and Rat Infections to Sentinels: A Systematic Review. PLoS One. 2016 Aug 12;11(8):e0158410. doi: 10.1371/journal.pone.0158410. PMID: 27518654; PMCID: PMC4982683.