肌萎縮性脊髓側索硬化症

因中樞神經係統內控製（zhì）骨骼肌（jī）運動的神經元退化導（dǎo）致的肌萎縮性脊髓側索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis： ALS，也稱（chēng）漸凍人症）是一種漸進且致命的神經退行（háng）性疾病。由於運動神經元退化和死亡，肌肉逐漸萎縮致大腦完全喪失控（kòng）製隨意運動的能力，最終會造成發音、吞咽，以及呼吸和運動障礙。著名物理學家霍金就是一名ALS患者。目前還沒有（yǒu）真正可有效治療ALS的藥物和方法。

絕（jué）大（dà）多（duō）數（90-95%）的ALS發病原因不明（míng），但（dàn）也有約5-10%的ALS患者表現出了家（jiā）族遺傳性，其中（zhōng）超氧化物歧化酶 1（Superoxide Dismutase 1：SOD1）基因突變約占這些（xiē）遺傳性ALS病例的10%。SOD1也是（shì）第一個被鑒定出來的ALS風險基（jī）因[1]，因此很快（kuài）就有（yǒu）科學（xué）家構建了一（yī）種含有（yǒu）第93位（wèi）甘氨酸突變為丙氨酸（G93A）的人SOD1基因的轉基因小鼠模型，全名為B6SJL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J轉基因小鼠[2]。該轉基因（yīn）小鼠基因組中被轉入了23個拷貝的人源（yuán）SOD1*G93A突變基因，接下來我們將其（qí）簡稱（chēng）SOD1*G93A轉基因小鼠。

圖二：SOD1*G93A轉基因小鼠是以B6和（hé）SJL雜交子代為（wéi）背景品係，通過原（yuán）核注射和胚胎移（yí）植得到的轉基因小鼠模（mó）型，因此其毛色（sè）多樣，圖片來自（zì）Jax實驗室（https://www.jax.org/strain/002726）

自1996年SOD1*G93A轉基因（yīn）小鼠問世以後，其就被廣（guǎng）泛應（yīng）用（yòng）於ALS藥物研發的臨床前動物試驗中。到2004年，短短8年時間內，已（yǐ）至少有（yǒu）50篇（piān）文章描述了從小分子到（dào）病毒（dú）載體的各類ALS治（zhì）療方案，可延長SOD1*G93A轉基（jī）因小鼠的壽命（mìng），其中最長可以延長壽命（mìng）100天（78%的壽命延長）。這些藥（yào）物很快進（jìn）入臨床試驗，然而，迄今為止，除了利魯唑（最多（duō）延長（zhǎng）ALS患者兩個月壽命）之外，沒有任何一種藥物顯示出對人類（lèi）ALS疾病的進程有顯著影響[3]。這給醫藥公司帶來（lái）了巨大損失，如2008年在（zài）美國國家科學院院刊上發表的一篇文章顯示鋰可（kě）以（yǐ）將（jiāng）SOD1*G93A轉基因小鼠的存活時間延長30天[4]。由於鋰早已經被用於治療精神（shén）分裂症，許多ALS患者開始超說明書服（fú）用該藥物，希望減緩疾病進程。然而，招募了數百名患者，花費了遠超1億美元的（de）三個（gè）同時啟動的獨立（lì）III期臨床試驗結果（guǒ）卻顯示鋰對ALS無任何（hé）治療效果。

其實（shí）不僅僅是ALS的藥物研發，在整個醫藥研發領域，動物（wù）實驗結果（guǒ）的（de）平均（jun1）臨（lín）床轉化率也是非常低的，平均（jun1）在11%左右  。那麽到底是什麽原因導致了如此高比（bǐ）例的動物實（shí）驗結果無法實現在人類的（de）臨床轉（zhuǎn）化呢？

1999年，美國麻省理工學院的機（jī）械工程師詹姆（mǔ）斯·海伍德在得知他的哥哥史蒂芬（fēn）·海伍德被確診患有ALS，並無任何（hé）有效（xiào）治療方法後，與家人一起創立了一家非盈利性生物技術公司，即ALS 治（zhì）療開發研究所 (ALS-TDI)。ALS-TDI成立後（hòu）開展了一項（xiàng）旨在（zài）尋找SOD1*G93A轉基因小（xiǎo）鼠實驗結果臨床轉化失敗原因的（de）項目，即使用SOD1*G93A轉基因小鼠重複已發（fā）表（biǎo）科研論文中的動物實驗，以找出其（qí）臨床轉化失敗的原因。

在ALS-TDI開（kāi）展的重複性實驗中，他們不僅嚴格執行盲法對照，而且對（duì）給藥（yào）組（zǔ）和對照組的動物進行了更為（wéi）精細的分配和動物篩查（chá）以（yǐ）排（pái）除係統誤差。他們分組及實（shí）驗要求包括：

⑴ 年齡（líng）匹配；

⑵ 性別匹配；

⑶ 同窩匹配：即使用同一天出生的同一非轉基因母親和轉基因（yīn）父親的後代進行分組（zǔ），具體來說，治療組中的每個雄性（和雌性）在對照組中都有（yǒu）一（yī）個（gè）同窩兄弟（和姐妹）；

⑷ 樣本量設（shè）定（dìng）：每（měi）組使用動物數量為24隻（zhī）（12雌，12雄（xióng））；

⑸ 死因篩查：檢查記錄每一隻動物的死亡原因，排出非ALS致（zhì）死個體（tǐ）；

⑹ 轉基因拷貝數監控：有（yǒu）研究證明SOD1*G93A轉基因小鼠在傳代過程中會（huì）出現轉基因拷貝數丟失的（de）現象（xiàng），且低拷貝的轉基因小鼠的平均壽（shòu）命會加長。

在這一嚴格（gé）實驗分組和動物篩查條件下，ALS-TDI的科研人員總共使（shǐ）用了5429隻SOD1*G93A轉基因小鼠測試了包括利魯唑在內的100多種（大部分已有（yǒu）論文發表並（bìng）證明可延長SOD1*G93A轉基因小鼠壽（shòu）命）候選化合物，卻沒有發現任一化合（hé）物表現出可延長SOD1*G93A轉基因小（xiǎo）鼠壽命的效果（圖三）。

圖三：ALS-TDI以SOD1*G93A轉基因小鼠（shǔ）開展的重複實驗結果（guǒ）與已（yǐ）發（fā）表實驗結果對（duì）比[3]

為找出導致那（nà）些已經發表實驗結果無法被（bèi）重複的原因，他們以在ALS-TDI開展實驗中所使用的2000多隻對照小鼠作為研究對象，進行了計（jì）算機分組模擬實（shí）驗。由（yóu）於這些小（xiǎo）鼠從出（chū）生（shēng）到死亡及死亡原因（yīn）的信息在ALS-TDI都有詳細的記錄，因此（cǐ）他們能夠以所有對照小鼠為數據庫，分析前述重複實驗中設定的不同分組和動物篩查條件對實驗結（jié）果（guǒ）的影響。即通過計算機對這些沒有經過任何藥物處理（lǐ）的（de）小鼠進行分組，將一組設為假定的實驗組，而另一組設為假定的對照組，然後依（yī）據已有的小鼠死亡時（shí）間記錄，統計兩組小鼠之間是否存（cún）在顯著差異。經過多次重複，計算（suàn）出現5%以上顯著差（chà）異的百分比（bǐ）。由（yóu）於這些對照小鼠沒（méi）有接（jiē）受過任何化合物處理，因此如果假定的實驗（yàn）組和對照組中出現了（le）顯著（zhe）性差異，那麽其來源應該是分組時的係（xì）統（tǒng）誤差。

結果顯示，在樣本量大小為4的計算機分組模擬對比實驗中，在隨機分組和不進（jìn）行（háng）死因篩查及排除低轉基因拷貝數個體條件下，兩（liǎng）組間出現（xiàn）顯（xiǎn）著差（chà）異的可能性超過了50%。而隨（suí）機分組的同時進行死因篩查並排（pái）除低轉基因拷（kǎo）貝數個體（tǐ）和進行性別（bié）匹配的（de）分組條件下，樣本量為4的模擬分組實驗中也有30%的可能出現兩組死（sǐ）亡時間的顯著差異（圖四）。隨著樣本量的增加，出現顯著性差異的可能性逐漸減少，但要實現低於（yú）5%（統計學上通常設置的顯著置信區間）的顯著性差異（yì），樣本量要達到每組24隻動物。如（rú）果不做分組條件控製，即使樣本量到（dào）50隻也難以（yǐ）排除係統誤差。

圖四：分組條件導致的係統誤差[3]

ALS- TDI的這個計算機模擬實驗結果（guǒ）說明，前述那些已經發表的基於SOD1*G93A轉基因（yīn）小鼠（shǔ）實驗結果無法（fǎ）實現臨床轉化的真正原因極大可能源於其實驗設計的不合理。這些實（shí）驗因為沒有排除分組時的係統誤差而導致（zhì）了假陽性結果。這個研究也暴露了當下使用實驗動物開展（zhǎn）研究的諸多問題（tí），如盲目地追求減少使用動（dòng）物的數（shù）量；對所用（yòng）動（dòng）物遺傳、微生物和繁殖等特性不了解；實驗過程中對動物關注不夠，不清楚動物發病或死亡的真正原因等。這些問（wèn）題（tí）不僅僅需要（yào）引起實驗動物從業人員的注意（yì），科研人員同樣需要（yào）給予關注。因為實驗設計不嚴謹導致的假陽性結果不僅（jǐn）是（shì）人力、物力和財力的巨大浪費，也嚴重有違動物實驗倫理福利，這樣的實驗不會帶來科學進步，且浪費了大量實驗動（dòng）物（wù）的生命。比如在ALS-TDI開展（zhǎn）的無法重複出已發表結果的實驗中（zhōng），那些已經發表的工作（zuò）累計使（shǐ）用小鼠的數量就（jiù）超過了18000隻。此外，在動物實驗倫理申請時（shí）常用替代、優化和（hé）減少（shǎo）（俗稱3R原則）原則來指導倫（lún）理審查工作，有時為（wéi）了滿足3R原則中的“減少”原則，加上（shàng）開展實驗成本的考慮，往往選擇使用最少的（de）動物數量（比如（rú）多為每組6隻），但從ALS-TDI的這（zhè）個研究看，樣本量過小（xiǎo），會導致係統誤差加大，因此（cǐ）極大可能出現假陽性結果。這（zhè）個時候大家或許忘了3R原則使用的大前提是要能夠（gòu）實現擬開（kāi）展實驗的科學目標，如果單純為了“減少”而使用更少（shǎo）的實驗動物導致科學目標無法實現，那不是減少，而是對動物生命的漠視。

參考文獻：

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