基於FELASA實驗小鼠遺（yí）傳質量控製（zhì）和遺傳檢測（cè）工作（zuò）組的（de）報告，本公眾號（hào）前期文章《實驗大小鼠（shǔ）的遺傳質量控製和遺傳監測: 標準化實（shí）驗大小鼠（shǔ）分類》一（yī）文介紹了常見標準化齧齒類動物和幾種獲得遺傳工程齧齒動物的基本方法（fǎ）。本文將繼續依據該報告的內容，重點介紹如何進行小鼠遺傳質量控（kòng）製和遺傳監測。

當你（nǐ）的設施有新構建或者引（yǐn）入一種GA（Genetically altered）齧齒類動物時，應完整記錄這些動物的詳（xiáng）細信（xìn）息。同時，這些（xiē）信息也必須伴隨著相應動物品係（xì）一起傳遞給所有可能會使用它的（de）研究者。這些信息（xī）包（bāo）括但不限於：正確的品係（xì）名稱、對於突變的完（wán）整描述、動物的遺傳背（bèi）景、基因鑒（jiàn）定方案和（hé）相關表型描述等（děng）。設施（shī）管理者可以設（shè）計一些固（gù）定格式的（de）表格用於記錄這些信息（xī）。

關於命名法重要（yào）性的概述，可以參考“FELASA轉基因齧（niè）齒動物生產和命名指南”。沒有一個公（gōng）認的命名法，就不可能準確地交流科學成（chéng）果。同時模糊或不完整的命名會引發錯誤，會使實驗結果的可重複性降低（dī）。因此，應根據國際命名規則命名不同品係。特別是當同（tóng）一品係被保存在世界（jiè）各地不同的設施或（huò）它們被加入數據庫中時，這一點顯得尤為重要。指導命名的規則由（yóu）國際小鼠和（hé）大鼠標準化遺（yí）傳命名委員（yuán）會製定，並不（bú）斷更新。這（zhè）些規則最近一次修訂是在2016年1月，在MGI網頁（yè）的“小鼠和大鼠品（pǐn）係命名指南”中有詳細描述。

遺傳變異的來源（yuán）

齧齒類動物設施麵臨的一（yī）個重要挑戰是保持近交係的遺傳（chuán）背（bèi）景純正，並將GA係動物維持在明確（què）的遺傳（chuán）背景之下。近交係的（de）遺傳變異可能由以下因素產生：（a）意外（wài）的雜交造成的汙染；（b）由（yóu）於殘留的雜合性或新的自發突變的固定造成（chéng）的遺傳漂變。遺傳變異的引入通常有以下幾種途徑：

（1）遺傳汙染

來自一（yī）個近交係的個體與另一個來源（yuán）的動物意（yì）外交配導致的基因汙染是近交係中遺傳譜係改變的最（zuì）重（chóng）要（yào）來源。這（zhè）種類型的基因汙染會導致（zhì）等（děng）位基因（yīn）發生突然的大規模改變，尤其在具有相同被毛顏色的品（pǐn）係中更容易發生，例如（rú）帶有白化等位基因(Tyrc /Tyrc )、agouti(A/A)或非agouti(a/a)的品係（xì）之間。因此在飼養具有相同被毛顏色的不同品係動物時需要格外小（xiǎo）心，盡可能防止其近距離接觸。有關小鼠（shǔ）毛色遺傳，可參閱本號前文《小鼠的（de）毛色是如何形成的？》

（2）自發突變

自發突變是在個（gè）體中由於自然存在的誘（yòu）變劑或DNA複製、轉錄、修（xiū）複時偶然出現的堿基配對錯誤而產生的突變（biàn），是（shì）一種不受（shòu）控製的遺傳變異來源，通常無法通過簡單的表型觀察或（huò）者常規的（de）遺（yí）傳監測發現。

（3）遺傳漂變

遺傳漂變是（shì）指某個小（xiǎo）群體中，由於新突（tū）變的出現以及殘留雜合性（xìng）的等位基因逐步固化（huà）在純合狀態，並取代了原來的等（děng）位（wèi）基（jī）因的（de）過程。

當同一品係在不同地方獨立繁殖時，遺傳漂變對品係的分化和亞品係的產生有不可忽視的作用（yòng）。小鼠亞品係的例子很多，例（lì）如，已發現（xiàn）有10個有記錄的BABL/c亞係和15個C57BL/6亞係，包括（kuò）來自傑克遜實驗室的C57BL/6J和來自美國國立衛生研究（jiū）院（NIH）的C57BL/6N亞係。同樣，許多大鼠近交係也至少有兩個亞係（xì），例如（rú）SHR至少有四個亞係，包括SHR/Ola和SHR/NCrl；WKY和（hé）F344至少各（gè）有三個亞係。

（4）乘客突變

乘客突變是指隱藏在亞係或者是GA係動物的基因組（zǔ）中的突變，這些突變（biàn）在某些特定情況下（xià）能（néng）夠影響到（dào）動物實驗結果。例（lì）如在最常見的C57BL/6中的兩個亞係C57BL/6J和C57BL/6N，由於一些自發（fā）的突變，如C57BL/6N中出現了可（kě）導致（zhì）視網膜退變（biàn）的Crb1rd8突變，而C57BL/6J中則出現了Nnt基因的缺失。正因這類乘客突變的存在，在進行表（biǎo）型分析時，要特別（bié）注意觀察（chá）到的表型是由於目（mù）標基因的（de）修飾還（hái）是遺傳背景中存在的突變造成的，並藉此選擇合適（shì）的對（duì）照組動物。

遺傳（chuán）質量控（kòng）製方案

目前實驗齧齒類動物的遺傳質量控製（zhì）金標（biāo）準是（shì）依靠（kào）遺傳標記多態性來區分不同的遺（yí）傳（chuán）背景。

遺傳標記是染色體上已知位置的特定DNA序列，是遺傳質量（liàng）控製的基本工具。遺傳質（zhì）量控（kòng）製（zhì）對確定動物（wù）的遺傳組成，確定（dìng）品係的一致性和真實性是必要的。值得注意的是，一般不（bú）會對（duì）封（fēng）閉群動物（wù）進行遺傳標記一致性的檢測，相反，應該對封閉群（qún）動物的遺傳異質性水平（píng）進行確認，以檢測遺傳汙染（rǎn），監測育種方（fāng）案的科（kē）學性。

標記係統

大鼠和小鼠（shǔ）中已經發現多種多態性，然而，在目前的質量保證方案中，隻有微衛星（xīng）DNA和SNPs被用（yòng）作遺（yí）傳標記物。微衛星標記，又被（bèi）稱為短串聯重複序列(short tandem repeats,STRs)或簡單重複序列（simple sequence repeats，SSR），是均勻分（fèn）布於（yú）真核生物（wù）基因組中的簡單重複序列，其典型結構是由2～6個核（hé）苷（gān）酸的序列串聯重複幾次到幾（jǐ）十次構成，這種重複造就了染色體之間的等（děng）位基因多樣性。微衛星標記通常（cháng）先（xiān）通過PCR方式擴增（zēng）包含微衛星序列（liè）的區域，再對擴增產（chǎn）物通（tōng）過電泳分析和片（piàn）段大小進行等位基因差異分析。

SNP分（fèn）型是微衛星標記的一種（zhǒng）替代方法，現（xiàn）在應用範圍更（gèng）廣。SNP多（duō）態性（xìng）是指在基因組水平上由單個核苷（gān）酸的變異所引起的DNA序列多態性（xìng），編碼區（qū）和非編碼（mǎ）區都有SNP的存在。

傑克遜實驗室的Petkov和（hé）他的同事從48個小鼠品係中（zhōng）的235個SNPs的等位基因中選擇了28個SNP，這些位點已足以（yǐ）區分傑克遜實驗室所保存的（de）約300個（gè）近交係、野生型、同類係、染色體置換係和（hé）重組近交係中的大多數動物。一些研究者也報（bào）道了（le）大鼠可用的SNPs。例如，Zimdahl和（hé）他的同（tóng）事描述了來自轉錄區的超過12,000個SNPs。

近交係和遠交係（xì）的遺傳監測

目前（在歐美國（guó）家）使用的主流的遺傳監測技術是基（jī）於微衛星或SNPs 的檢測。然而（ér），我們建議（yì），除了分子技術，同時也應該（gāi）監測（cè）動物的表型參數，如（rú）毛色、行為和繁殖能（néng）力等。商業育種者（zhě）對控製遺傳汙染的（de）發生應更為重視，並（bìng）定期監測其品係的遺傳質量。傑克（kè）遜（xùn）實驗室采用了一種獨特的、已獲專利的遺傳穩定計劃，即（jí）通過每五代就重新從純種的、冷凍的胚胎中（zhōng）重建他（tā）們的基礎種群來有效地限製遺傳漂變的積（jī）累。例如，從2005年（nián）開始，他們出售的C57BL/6J小鼠都是兩隻選定的（de）小鼠的後代，而他（tā）們冷凍的數百個胚胎足以持續使用25-30年。特別需要注意（yì）的是，當（dāng）從冷（lěng）凍庫存中複蘇（sū）胚胎時，也應進行遺傳檢測，以確保冷凍前及冷凍過程中沒有（yǒu）發生遺（yí）傳汙染或其他錯（cuò）誤。

對於遠交係，遺傳監測有助於保持群體的遺傳多（duō）樣性和等位基因庫。這個過程更為複（fù）雜，需要分析大量的動物，並將這些數據與曆史數據進行比較，記錄（lù）存在的等位基因（yīn）、它們（men）的（de）頻率和該特（tè）定群體的雜合度水平。在某些情況下遺傳（chuán）多樣性缺失的結（jié）果會導致一個群體（tǐ）的異質（zhì）性降到較低水平。低異質性可（kě）能是源於繁殖種群的選擇不當，繁育體係執（zhí）行中的偏離，或是（shì）起始的繁殖群體過小。相反，過高的異質性可能是由近期出現的遠交造成的。大體上，需通過測量表型性狀和計算相（xiàng）應的平均值和標準差來描述遠交係的基本特征。對遠交係遺傳控製的原則是避免近親繁（fán）殖（zhí）並在各代中保持其遺傳多樣性。

自繁近交係小鼠和大鼠的遺傳監（jiān）測（cè）

建議從可靠的供應商購處買（mǎi）動物，並在10代後用同一供應商的動物替換繁殖種群，不建議長期維持經典近交品係的獨立種群。使用來自（zì）同（tóng）一供應商的動物（wù）可以有效的防止產（chǎn）生突變的亞品係。同時（shí），自繁動物也應該（gāi）用微衛星標記（jì）或SNPs檢測進行遺傳質（zhì）量監測（cè），以確保其遺傳質（zhì）量的可靠性。

微（wēi）衛星檢測可以用於驗證近交係小（xiǎo）鼠品係背景（jǐng）的純度，是否（fǒu）有遺傳汙染的痕跡。這對於在同一飼養間內飼養具（jù）有相同毛色的品係的（de）動物設施，尤其（qí）是在不使用IVC籠具的設施來說尤其重要。微衛星檢測的標（biāo）記物數量尚未標準（zhǔn）化，標記物的選擇應根據設施維（wéi）持品係的種類和數量進行相應（yīng）的調整。

由於近交係動物（wù）的基因序列高度一致，基因都（dōu）是純（chún）合的，當對一個特定的微衛星位點進行基因分型的時候，在電泳時隻會呈現單一（yī）條帶，代表一個等位基因，而任何雜合性的存在，例如有兩個條帶或者與對照組條帶大小不一致時，就應該被視為有潛在的汙染（圖1）。

圖1. 通過SSLP PCR檢測基因汙染的例子

圖片是PCR擴增後得到（dào）的特征條帶，這些條帶來自四隻據稱屬（shǔ）於BALB/c品係的小鼠的基因組DNA(每組的前四個泳道)，加上BALB/c的標準（zhǔn）DNA對照(最後一個泳道)。本圖片隻顯示了位於1至5號染（rǎn）色體上的（de）五個（gè）SSLP位（wèi）點。可見存在雜合性(兩條帶)和不符合BALB/c標準的條帶大（dà）小的條帶存在。

對於種群數量較小，且采用隔離飼（sì）養，也（yě）沒有高（gāo）頻次動物引進的設施，每兩年一次檢測就可以有（yǒu）效的監測動物遺（yí）傳質量。

使用SNP組監測動物遺傳質量時，利用均勻分布在染色體上的（de）四十多個SNPs就（jiù）可（kě）以有效檢出近期發生的遺傳汙染，檢測（cè）位點數量可根據每個機構的實際情況和設（shè）施麵對的（de）風險程度而定。SNP基因分型目（mù）前可以在不同（tóng）的平（píng）台上進（jìn）行，其成本和自動化能力各不相同。Kompetitive Allele Specific PCR(KASP)和Taqman實時熒光定量PCR是常用的檢測方式，相比較而言（yán），前者的自動化程（chéng）度更高，成本（běn）更（gèng）低，但對檢測樣本量的下限有（yǒu）一（yī）定要（yào）求。

遠交係種群的（de）遺傳質量（liàng）監測

遠交係的遺傳質量監測比近交係要複雜的多，因為這些（xiē）動物的（de）基因並不一樣，它們本質上是一群密（mì）切相關的動物，有共同的祖先和群體特征，但表（biǎo）現出一定程度的遺傳多樣性，所以僅僅（jǐn）用少量的（de）遺傳標記就很難建立一個標準的遺傳監測方案。然而（ér），通過監測足夠數量的SNPs或者SSLPs位點（diǎn），就可以說明群體內的等位基因頻率和種群的遺傳特征。

遠交係遺傳質量控製麵臨的主要問題之一是（shì），許多管理者用非常小規模的繁殖種群，導致（zhì）種群中有代表性的等位基（jī）因數量減少，增加（jiā）了近親繁殖係數，這種種群既（jì）不是真正（zhèng）意義上的遠交係，也不是近交係。因此，如果無法維持適當基數的繁殖種群的時（shí）候，就建議從那些有大規模繁殖種群的供應商處購買（mǎi）遠交係動物，或者遵循推薦的繁（fán）殖方案，以減少近親繁殖。

參考文獻：

[1] Benavides F , T Rülicke,  Prins J B , et al. Genetic quality assurance and genetic monitoring of laboratory mice and rats: FELASA Working Group Report:[J]. Laboratory Animals, 2020, 54(2):135-148.