最（zuì）近驚聞一位朋友因患一種名為肝豆狀核變性的罕見（jiàn）病而離世，突感罕見病（bìng）並不罕見，它往往就在我們身邊。因筆者對肝豆狀核變性研究有所涉獵，本文將對該（gāi）病及其（qí）動物模型作（zuò）簡要介紹。

01、首次發現及致病機製

肝豆狀核變性又名Wilson病(Wilson’s disease，WD) ，1912年首次由Samuel Kinnear Wilson博士描（miáo）述。該病表現為（wéi）“漸進性豆（dòu）狀核退化”，在患者的肝（gān）髒和（hé）大腦（nǎo）等器官中發現了過量（liàng）的銅，該病在（zài）全球的患病率約為1/30000。經過多（duō）年研究，肝豆狀核變性（WD）的發（fā）病機製已經研究的較為清楚，它是一種常染色體（tǐ）隱性遺傳銅代謝障礙疾病[1]。1993年三個獨立研究小組幾乎同時（shí）發現了ATP7B基因為Wilson病（bìng）的致病基因。該基因編（biān）碼銅轉（zhuǎn）運P型 ATP酶 ( copper-transporting P-type ATPase，ATP7B)[2]，WD患者攜帶發生突變的ATP7B基因（yīn），血清銅藍蛋白合成及正（zhèng）常的銅（tóng）代謝過程發生障礙，過量的銅沉積在組織器官中，如肝髒、大腦、腎髒、角膜中，其中最常受累（lèi）的是肝髒和神經係統[3]。

圖1.ATP7B蛋白結構圖

圖注：N-端包含六個結合（hé）銅的金屬結合結構域（yù）（MBD1-MBD6，青色）；參（cān）與Cu配位的殘（cán）基在膜內的位置為CPC、YN和MXXXS；位於（yú）C末端的兩個（gè）亮氨酸基序（1459LL和1487LL）對胞吞作用和TGN從質膜重新定位至關重要[4]。

02、臨床（chuáng）表現及診斷

WD患者在臨床（chuáng）表現上包括嚴重程度不等的肝（gān）損傷、持續性血清轉氨酶升高、急性或（huò）慢性肝炎、代償期或失代償（cháng）期肝硬化和（hé）暴（bào）發（fā）性肝功能衰竭（jié）等[5]。神經係統的表現以椎體外係病變症狀為主，包括僵硬、震（zhèn）顫、運動遲緩、構音障礙（ài）、吞咽障礙、舞蹈症狀、癲癇發作等（děng），精神症狀包括躁狂、性格改變、抑鬱等[6, 7]。此外腎髒、血液係統（tǒng）及骨關節等器官（guān）係統，也會出現相應的臨床症狀（zhuàng）和體征。

患者（zhě）出現以下（xià）一些症狀（zhuàng）或指標可供臨床診斷：

1. 角膜K-F環是（shì）某些WD患者一個比較明顯的特征。K-F環（huán）為角膜邊緣的黃綠色或黃灰色（sè）色素環，一（yī）般（bān）在手電筒側光照射下肉眼可見（jiàn），7歲以下患者一般（bān）無法檢出角膜K-F環。

2. 肝脾檢查：肝（gān）功能血清轉氨酶、膽紅素升高和（或）白蛋白降低；肝脾B超：常顯（xiǎn）示肝實質光點（diǎn）增（zēng）粗、回聲增強甚至結節狀改（gǎi）變；部分患者脾髒腫大；肝（gān）髒MRI檢查常顯示肝脂（zhī）質沉積、不規則結節及肝葉（yè）萎縮等。

3. 采用銅代謝相關生化檢查，銅藍蛋白<120mg/L，24小時尿銅≥100μg。

4. 顱腦MRI檢查（chá）主要表現為殼核、尾狀核頭部、丘腦、中腦、腦橋及小腦T1低（dī）信號、T2高信（xìn）號（hào），少數情況下可出現T1高信號或T1、T2均（jun1）低信號。

5. 基因篩查：對於臨床證據（jù）不足但又高度懷疑WD的患者，篩查ATP7B基因（yīn）致病（bìng）變異對診斷具有指導意義。

圖2. 角膜邊緣黃色渾濁（zhuó）的K-F環

03、ATP7B突變類型及地理（lǐ）分布（bù）

ATP7B基因突變在不同種族和地域中存在遺傳異質性。歐洲人（rén）群最（zuì）常見的突變類型是14號外（wài）顯子上的 H1069Q突變，在意大利、瑞典和羅馬尼亞（yà）等地多見，臨床主要以（yǐ）錐體外係症狀為主（zhǔ），如震顫、肌張力障礙、精神症狀等。亞（yà）洲人群最常見的突變類型是 8號（hào）外顯子上的錯義突變R778L，以中國、韓（hán）國和（hé）日本最多見，臨床以肝髒方麵症狀為（wéi）主，如肝功能異常、肝硬化、肝脾大等；其餘常（cháng）見的還（hái）有 P992L、Q1399R等[8]。

04、肝豆狀（zhuàng）核變性動物模型

1. “毒乳”( toxic milk，TX)小鼠（shǔ）

肝豆狀核變性動物模型（xíng）中最有名的是一種“毒乳”( toxic milk，TX)TX小鼠。 “毒乳”小（xiǎo）鼠這一名稱（chēng）源自雌（cí）性純合子TX小鼠乳汁中缺乏銅，因此（cǐ）其哺乳的幼鼠在2周左右時會由於銅缺乏而死亡（wáng）。後續研究證明“毒乳（rǔ）”為ATP7B基因突（tū）變小鼠。

TX小鼠又分為兩種，一種是1974年由Harold Rauch在DL近交係（xì）小（xiǎo）鼠F68代中發（fā）現的自然突變，後來（1996年）被鑒定為ATP7B基因（yīn）外顯子20中4066位的A到G堿（jiǎn）基變化，導致第八跨膜區M1356V（甲硫氨酸to纈氨酸）的改變。TX鼠於第3周開始出現銅（tóng）在髒器的沉積，首先是肝髒和腦，以（yǐ）肝髒（zāng）為重，至第4個月銅沉積最為顯著，可（kě）達對照組的60~80倍。同（tóng）期腎髒亦有大量沉積。這種由肝至腦再到腎的銅沉積過程與WD患者的一般臨床病程（chéng）相（xiàng）似[9]。

另一（yī）種TX小鼠是1987年在傑克遜實驗（yàn）室的C3H/HeJ群體中出現的自然突變品係TX-J小鼠，現對外出售，編號001576。該突變小鼠是ATP7B基（jī）因外顯子8中2135位的G到（dào）A的堿基突變。與TX小鼠相似，TX-J小鼠與WD患者以相似的（de）方式在肝髒中積累銅（tóng），成年純合子TX-J小鼠會發展為肝硬化。

TX和TX-J小鼠不能完全模擬WD患者，其角（jiǎo）膜無K-F環；與WD患者的肝髒損傷也（yě）有顯著差異；且沒有關於（yú）人（rén）類WD母親的嬰兒銅缺乏現象的報告；另外TX小鼠缺乏明顯神經係統症狀，TX-J小鼠也隻有輕微的行為異常。但TX和TX-J小鼠ATP7B mRNA的轉錄水平沒有明顯改變且ATP7B基因功能部分保留，並具有與WD患者相類似的（de）病理過程和銅生化（huà）特征，同時也由（yóu）於其（qí）容易獲得，是目前使用最多的WD動物模（mó）型之（zhī）一，廣泛應（yīng）用於一些治療藥物的試驗。

2. ATP7B基因修飾小鼠

利用同源重組（zǔ）技術或（huò）CRISPR基（jī）因編輯技術敲除ATP7B基因第2外顯子獲得的ATP7B-/-基因敲除小鼠也越來越多的被用於WD研究。ATP7B-/-基因（yīn）敲除小鼠具有與人類WD和TX小鼠相似的銅沉積表型，但與TX鼠模型相比發病較早且肝損傷更嚴重，肝炎、壞死性炎症、膽管增殖、纖（xiān）維化，甚至後續（xù）的腫瘤發生（shēng）等症（zhèng）狀都比（bǐ）TX鼠更接（jiē）近人類WD的肝髒病理結（jié）果。

隨著基因編輯（jí）技術（shù）的進展，采用基因編輯工（gōng）具CRISPR/Cas9+ssDNA[10]，或采用堿基編（biān）輯（Base Editor）、先導編輯（Primer editor）技術，結合胚胎操作術可以較輕鬆地在小鼠ATP7B基因上構建與人類WD同源的（de）突變位點。理論上可以獲得更接近人類（lèi）WD特征的小鼠模型。

3. LEC(Long–Evans Cinnamon)大（dà）鼠

LEC大（dà）鼠是一種近交係突變大鼠，最（zuì）初是從Long–Evans大鼠群體中分離出（chū）來（lái）的，它的ATP7B基因在3’端編碼區缺失了900個堿基，以及（jí）下遊未翻譯區（qū）缺失（shī）了約400個堿（jiǎn）基（jī）。LEC大鼠主要表現出自發性肝銅異常積聚（jù）伴（bàn）隨低血清銅和低銅藍蛋白，大約4月齡時出現暴發（fā）性肝炎或暴發性肝衰竭、轉氨酶和（hé）膽紅（hóng）素升高，部分或大量肝細胞壞死，病死率至少30%～40%，存活下來的大鼠多在12月（yuè）齡時發生肝（gān）纖維化並伴有肝細胞癌和膽管癌。由（yóu）於（yú）肝病進展迅速，LEC大鼠（shǔ）特（tè）別適（shì）合幹預（yù）治療研究，如各（gè）種（zhǒng）排銅絡合劑和（hé）幹細胞治療研（yán）究等。

圖3. LEC(Long–Evans Cinnamon)大鼠（shǔ）

4. 其他大型哺乳（rǔ）動物模型

一些（xiē）大型哺乳（rǔ）動物（wù）在銅代謝方麵也存在（zài）遺傳缺陷，均（jun1）表現出銅在肝髒中積累和銅毒性，例如犬(杜賓犬、拉布拉多（duō）尋回犬、貝靈頓梗犬Bedlington Terrier)和北羅（luó）納德賽羊（yáng）等。然而這些（xiē）大型哺乳動物銅代謝方麵的遺傳缺陷與人類WD並不相同，如貝靈頓梗犬，導致其肝銅積累的遺傳缺陷是（shì）由（yóu）於（yú）COMMD1（MURR1）基因39.7kb的刪除，而非ATP7B基因，故作為人類WD模型的作用有其局限性[11, 12]。若能在大（dà）型哺乳動物（wù）甚至非（fēi）人靈長類動物的ATP7B基因（yīn）中引入突（tū）變，或（huò）將造就更好模擬（nǐ）人類（lèi）WD的動物模型（xíng）。

05、肝豆狀核變性的治療

在目前的治療方案中（zhōng），WD患者需進（jìn）行（háng）終生治療，主要目標為治療銅過載。基本原則包括低銅飲食（shí）：避免（miǎn）或限製富（fù）含銅的食物，如肝髒、水生貝殼類動物（wù）、堅果、巧（qiǎo）克力、豆類、蘑菇（gū）等。藥物治療方麵以青黴胺、曲恩汀為代表的金屬絡合劑增加銅的排除，以鋅劑為代表的藥物減少銅的吸收。治（zhì）療越早越好，患者通常不能（néng）停藥，因為治療中斷很可能（néng）導致失代償性肝損傷及神經不（bú）可逆損傷。

值得注（zhù）意的（de）是WD的藥物治療有一定的局限性，除需要終生（shēng）治（zhì）療外，約1/3 WD患（huàn）者用藥（yào）期間會出現與藥物相關的不良事件，導致不（bú）得不更換藥物，甚（shèn）至可能導致治療（liáo）失敗，WD晚期導（dǎo）致的肝衰竭或失代償期（qī）肝（gān）硬化需要進行（háng）肝（gān）移植，這可能是最後（hòu）的常（cháng）規治療手段。

鑒於WD是非常明確的由（yóu）ATP7B基因突變所致的疾病，因（yīn）此基因治療或許有廣闊的（de）前景。目前已有基於（yú）動物模型的WD基（jī）因治療研究。如Murillo等（děng）在研究中用編碼人ATP7B cDNA的AAV8載體轉導到（dào）ATP7B-/-小鼠模型的肝髒，發現治療後血清（qīng）轉氨酶降低（dī），尿銅排（pái）泄量減少（shǎo），血清全血漿蛋白的正常化[13]。此外，2019年Liu等通（tōng）過CRISPR/Cas9替換了小鼠模型中ATP7B基因（yīn）的第8外顯子[14]；2020年（nián）Michael等使用CRISPR/Cas9+ssODN的方法糾正人類細胞（bāo）係中的ATP7B點突變[15]。筆者嚐（cháng）試用一種ABE堿基編輯器（qì）輸（shū）入到TX-J小鼠肝髒，觀察到了小鼠血清轉氨酶降低，以及低比例的肝（gān）細胞ATP7B點突變被糾正（數據不展示）。總之，基因治療的進展（zhǎn）為WD患者帶來了希望，但基（jī）因治療還處於基礎研究到臨床研究轉化的階段，還有（yǒu）很多不成（chéng）熟的地方需要不斷完善和革新。期望它將來能成為治療肝豆狀核變性的一線療法。

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